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微滴数字PCR技术检测婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌定量(二)

发布时间:2022-11-18 15:15 作者:北纳生物编辑-陈丹

2 结果与分析

2.1 引物探针特异性验证

以7 株双歧杆菌及10 株近源乳酸菌培养物原液提取的DNA为模板,应用表1中的双歧杆菌引物探针进行ddPCR扩增,7 株双歧杆菌均出现蓝色的阳性油滴信号,其他10 株乳酸菌均未扩增呈阴性,为灰色油滴信号,表明选取的双歧杆菌引物探针特异性较好,能够满足双歧杆菌的检测。

2.2 引物探针浓度优化结果

以动物双歧杆菌乳亚种HN019的DNA为模板,对3 组引物探针浓度进行ddPCR扩增,结果如图1所示,3 组浓度的ddPCR扩增荧光信号强度无明显差异,阴阳性微滴之间的荧光振幅差异不明显,故选择最适合实际应用的引物探针浓度为第3组:500、500、250 nmol/L。


图1 引物探针浓度优化

2.3 退火温度优化结果

选择ddPCR扩增体系的退火温度53、53.5、54、55、56、58 ℃进行优化实验,结果如图2所示,退火温度在53~58 ℃范围内均有荧光信号被检出,阴阳性微滴有明显分界,且阴阳性油滴之间的扩增振幅逐渐增大,在58 ℃达到最大扩增振幅,且在此温度条件下阴阳性油滴间的弥散油滴数量适中,表明ddPCR非特异扩增较少,故选择58 ℃作为反应最佳退火温度。


图2 退火温度优化

2.4 双歧杆菌纯培养液的ddPCR检测及平板计数

对双歧杆菌纯培养液进行梯度稀释并应用平板计数方法,得到原始菌液浓度为1.1×108 CFU/mL,其对数值为8.05。ddPCR对原始菌液梯度稀释至10-7检测,ddPCR在10-1稀释度模板浓度过高,达到检测上限,无阴性油滴,仪器无法推算模板浓度,需要适当稀释才能确定,在10-7稀释度由于模板浓度过低,达到检测下限,无阳性油滴,仪器无法推算模板浓度。如图3所示,10-2~10-6稀释度菌液ddPCR均能检测到阳性及阴性油滴。如表3所示,ddPCR检测得到原菌悬液定量对数值在8.13~8.47(lg(CFU/mL))之间,CV值在4.31%~12.76%之间,均小于20%,重复性较好,且与平板计数测定值相差在0.5(lg(CFU/mL))值之间,偏差小于10%(表3),与平板计数定量结果一致性较好。在10-6稀释度菌液达到ddPCR方法的检出限,菌液定量结果为296 CFU/mL。

图3 梯度稀释纯菌液ddPCR扩增

表3 纯菌液ddPCR定量

注:偏差/%=(ddPCR测定值-理论值)/理论值×100,以平板计数8.05(lg(CFU/mL))为理论值。

2.5 模拟双歧杆菌婴幼儿配方乳粉样品的平板计数及ddPCR检测

10-1~10-5稀释度菌悬液添加水平的婴幼儿配方乳粉样品的平板计数结果分别为3.5×107、3.6×106、4.3×105、3.3×104、3.8×103 CFU/g。同时ddPCR方法对于加入婴幼儿配方乳粉食品基质的双歧杆菌定量结果,分别为2.76×107、3.38×106、6.57×105、4.56×104、7.30×103 CFU/g,在103~107 CFU/g样品浓度范围中测定结果CV值在3.92%~15.80%之间,重复性较好,与平板计数定量对数值偏差范围在1.37%~7.80%之间,偏差小于10%,与平板计数定量结果一致性较好,模拟样品的检出限为7.30×103 CFU/g。

2.6 实际婴幼儿配方乳粉样品的平板计数及ddPCR检测

对市售不同厂家仅含有双歧杆菌的婴幼儿配方乳粉进行双歧杆菌平板计数定量检测,检测结果显示,活菌数均不小于106 CFU/g,符合产品标准要求,与标签标识相符。同时应用已建立的ddPCR方法进行检测,样品定量检测结果均大于106 CFU/g,且ddPCR定量值与平板计数定量值相差在0.5(lg(CFU/g))值之间,偏差小于10%,结果一致性较好。由此可知本研究所建立的对婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌的ddPCR定量检测方法可应用于实际样品的双歧杆菌的定量检测。

3 讨论

近年来,ddPCR检测技术因其灵敏度高、快速等优点在食品检测中应用日益增多。魏永新等利用ddPCR技术对食品中Escherichia coliO157∶H7进行检测,细菌纯培养液中最低定量为105 CFU/mL,人工污染三文鱼样品中检出限为110 CFU/g;刘洋等[25]基于ddPCR技术建立饮料中嗜酸乳杆菌的定量检测方法,方法灵敏度达到0.25 pg/μL,重复性的相对标准偏差在2.34%~6.10%之间;Hansen等[26]报道了PMA结合基因芯片dPCR技术同时检测混菌样品中L.acidophilusNCFM和B.animalissubsp.lactis Bl-04的活菌数量,相对标准偏差分别为5%和4%,显著优于平板计数法(15%),可见该方法精确度高,稳定性强。

本研究利用双歧杆菌特异性引物建立ddPCR定量检测方法,并对模拟和市售添加双歧杆菌的婴幼儿配方乳粉进行测定。首先查阅文献确定双歧杆菌特异性单拷贝rpsL基因,并设计特异性引物探针,避免了多拷贝基因由于定量拷贝数的变化而使得ddPCR检测结果准确度降低的问题。其次获得高质量及准确浓度的模板DNA是ddPCR准确定量的决定因素,由于双歧杆菌是革兰氏阳性菌、细胞壁不易破碎,且婴幼儿配方乳粉含有大量蛋白质分子且成分复杂,对提取高质量的模板DNA增加难度,因此分别对双歧杆菌DNA和婴幼儿配方乳粉中的双歧杆菌提取方法进行优化;最后由于ddPCR检测原理是将阳性微滴数和阴性微滴数用泊松分布公式计算出DNA分子的拷贝数,因此阴阳性油滴之间的荧光振幅能够在一定程度上反映出ddPCR方法的准确性和扩增效率,而ddPCR条件的退火温度及ddPCR中引物探针的浓度,都会对荧光振幅产生影响,由此对这2 个参数进行优化,建立婴幼儿配方乳粉中ddPCR定量检测双歧杆菌的快速检测方法。

本研究将ddPCR检测方法应用于婴幼儿配方乳粉中的双歧杆菌检测,所建立的ddPCR检测方法对双歧杆菌菌纯培养液的检出限为296 CFU/mL,模拟样品检出限为7300 CFU/g,CV值均小于20%,重复性较好。对市售添加双歧杆菌的婴幼儿配方乳粉样品进行检测,表明ddPCR检测方法和平板计数检测方法检测定量偏差小于10%,结果一致性较好。现行有效的食品中双歧杆菌定量检测方法为平板计数法,一般检验周期为3 d左右,本研究所建立的方法可将检验周期减少至1 d左右,且具有特异性好、准确度高等优点,适用于婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌的定量检测工作。由于婴幼儿配方食品基质复杂,且不同生产厂家的婴幼儿配方食品中添加的原辅材料多有差异,可能影响双歧杆菌DNA模板提取效果,进而对ddPCR检测准确度有一定影响,未来还需要对不同婴幼儿配方食品基质中的双歧杆菌提取方法进行研究,研究出更简便、高效的提取方法,以适应于婴幼儿配方食品的益生菌定量检测的快速检测要求。

本文章来源于——《食品科学网》,如有版权问题,请与本网联系

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