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微滴数字PCR技术检测婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌定量(一)

发布时间:2022-11-17 09:05 作者:北纳生物编辑-陈丹

随着益生菌与婴幼儿健康关系研究的不断深入,婴幼儿配方乳粉中添加活性益生菌成为一种趋势。段文锋等调研发现,市场常见的添加益生菌的婴幼儿配方乳粉中,50%以上的产品使用了双歧杆菌,添加最多的是动物双歧杆菌Bb-12,其次还有动物双歧杆菌乳亚种HN019、Bi-07和嗜酸乳杆菌NCFM。双歧杆菌作为一种重要的益生菌,是一种专性厌氧的革兰氏阳性菌,至今已有大量研究表明双歧杆菌能够调节婴幼儿肠道的菌群平衡,改善婴幼儿的免疫系统,有效促进婴幼儿正常生长发育。由于婴幼儿是特殊的敏感群体,为了规范菌株使用,2011年原卫生部发布了《可用于婴幼儿食品的菌种名单》,明确列出婴幼儿食品中可使用的菌种名称及菌株号,截至目前,经国家卫健委批准可应用于婴幼儿食品的益生菌共13 株11 个菌种,主要以双歧杆菌和乳杆菌为主。

婴幼儿配方乳粉中添加益生菌种类的规定保证了其安全性,而益生菌产品的活菌数是保证其功能特性的关键因素,婴幼儿配方乳粉系列食品安全国家标准均对保质期内产品中益生菌的活菌数目进行了规定,规定产品中活菌数应不小于106 CFU/g(mL)。针对双歧杆菌定量检测的现行有效国家标准采用的是平板计数法,该方法在实际应用中存在耗时长(一般为72 h)、工作量大和操作较繁琐等缺陷。近年来,以实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)为代表的分子生物学技术也逐渐被广泛应用到益生菌的定量检测工作中。相比较于传统培养法,real-time PCR快速、灵敏、特异,但该方法属于相对定量,结果的准确性和重复性在很大程度上依赖于所绘制的标准曲线质量及扩增效率,并且需要具备已知浓度的核酸标准品。

新兴的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)被认为是第3代核酸扩增技术,通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布到10 000~20 000 个微滴中,使大部分微滴中DNA分子的数量为1或0,然后通过PCR扩增和阳性信号的累积读取阳性反应单元数,采集阳性信号与阴性信号的比例,再根据泊松分布计算出样本中的DNA分子数,从而实现对DNA分子的绝对定量。目前该技术在食品领域的应用日益增多,主要应用于食源性致病菌检测、转基因植物检测、动物源性成分检测等方面。国内鲜见ddPCR技术应用于婴幼儿配方食品中双歧杆菌检测的文献报道,针对现有检测方法的不足,本研究拟采用ddPCR检测技术建立针对婴幼儿配方食品中常见益生菌的快速准确定量方法,旨在为婴幼儿配方食品中益生菌的定量检测提供新的思路,为监管部门对益生菌婴幼儿配方乳粉实现有效监管提供有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

Q×200 ddPCR仪 美国伯乐公司;PCR仪 美国ABI公司;高速离心机(转速≥12 000 r/min)、加热混匀仪 德国Eppendorf公司;BILON-08无菌匀质器上海比朗仪器有限公司;Incucell型恒温恒湿培养箱 德国MMM公司;1300 Series A2型生物安全柜 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取

1.3.1.1 标准菌株核酸提取

采用改良后的细菌基因组DNA提取试剂盒,将活化后第3代的菌株培养物原液1 mL放置离心机内12 000 r/min离心5 min;倒掉上清液,加入溶菌酶200 µL,37 ℃消化1.5 h;加入蛋白酶K 50 µL,细菌基因组DNA提取试剂盒中提供的缓冲液GA 150 µL,56 ℃消化1.5 h。后续用细菌基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取。

1.3.1.2 婴幼儿配方乳粉样品核酸提取

参考文献,对婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌基因组DNA的提取方法进行优化:将婴幼儿配方乳粉以质量比1∶10溶于0.85%生理盐水中,取1 mL乳液样品12 000 r/min离心10 min;去掉上清液及脂肪,加入1 mL PBS溶液12 000 r/min离心5 min;-20 ℃冰箱放置1.5 min,100 ℃加热混匀仪放置1.5 min,反复处置样品6 次;加入200 µL PBS溶液,100 µL蛋白酶K以及1 µL Triton X-100,56 ℃消化1.5 h;12 000 r/min离心5 min去掉上清液,加入200 µL溶菌酶37 ℃消化1.5 h;加入蛋白酶K 50 µL,细菌基因组DNA提取试剂盒中提供的缓冲液GA 150 µL,56 ℃消化1.5 h。后续用细菌基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取。

1.3.2 ddPCR体系及检测

配制ddPCR体系,体系为2×探针法ddPCR预混液10 µL,将引物稀释到10 µmol/L,取2.25 µL上下游引物和1.0 µL探针加入体系,加入2 µL的模板,最后用灭菌双蒸水补足20 µL。

将充分混匀的ddPCR体系转移到微滴发生卡中,并向微滴发生卡中加入70 µL微滴发生专用油,将微滴发生卡放到微滴发生器中进行反应。随后将生成的40 µL微滴液转移到ddPCR的96 孔板中,用封膜仪对96 孔板封膜,准备进行ddPCR。

ddPCR程序:95 ℃预变性10 min;94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,进行43 个循环;98 ℃固化微滴10 min。

ddPCR结束后将96 孔板放入QX200 Droplet Reader仪器中,依次录入样品信息,根据Quantasoft软件计算出最终结果(copies/20 µL)。

1.3.3 引物探针设计及特异性实验

查阅文献[23]筛选出的双歧杆菌单拷贝特异基因rpsL,在基因上设计引物探针序列,利用Primer Premier 6.0设计引物探针,并通过Oligo 7.37进行验证,再进行BLAST在线比对后,设计出一对引物探针,如表1所示,探针5′端标记FAM,3′端标记BHQ。对7 株双歧杆菌及10 株近源乳酸菌按照1.3.1.1节方法进行DNA提取,并对引物探针应用ddPCR检测方法对双歧杆菌同源及近源菌种进行检测,验证引物探针的特异性。

表1 ddPCR引物和探针序列

1.3.4 ddPCR条件优化

1.3.4.1 引物及探针浓度优化实验

设置3 组待优化的上下游引物及探针浓度,如表2所示,以动物双歧杆菌乳亚种HN019的DNA为模板,使用上述筛选得出的一对引物探针对3 组浓度分别参照1.3.2节进行ddPCR检测,根据微滴检测仪生成的结果,筛选出最优的引物探针ddPCR浓度。

表2 3 组引物探针浓度

1.3.4.2 ddPCR退火温度优化实验

在设计ddPCR扩增的反应程序时,以动物双歧杆菌乳亚种HN019的DNA为模板,使用上述筛选得出的一对引物探针和相应浓度,以1.3.2节的ddPCR体系为基础,对ddPCR退火温度进行优化。设置退火温度为53、53.5、54、55、56、58 ℃梯度ddPCR,根据微滴检测仪生成的结果筛选出最佳退火反应温度。

1.3.5 双歧杆菌纯培养液的平板计数及ddPCR检测

1.3.5.1 平板计数

对动物双歧杆菌乳亚种HN019培养物原液选取合适稀释度进行平板计数,依据GB 4789.34—2016《食品微生物学检验 双歧杆菌检验》方法,每个稀释度做2 个平皿,置于37 ℃厌氧培养48~72 h,观察菌落生长情况。选取菌落数在30~300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数,每个稀释度菌落数应取2 个平板计数结果的平均值。

1.3.5.2 双歧杆菌培养液ddPCR检测

将37 ℃厌氧培养48 h的动物双歧杆菌乳亚种HN019培养物原液至10-7稀释菌液,应用1.3.2.1节方法提取DNA,应用已建立的ddPCR检测方法进行检测,每个浓度梯度检测重复3 次,借助SPSS 14.0进行统计学分析,计算变异系数(coefficient of variation,CV)。灵敏度根据拷贝数定量出的菌液浓度,同时与平板计数方法测定结果比较,确定定量范围,并得到检测限。

ddPCR 可直接测得每反应的目标基因拷贝数(copies/20 µL),ddPCR的拷贝数与对应菌悬液浓度的换算关系公式如下:

式中:C 为根据ddPCR 拷贝数换算得到菌悬液的浓度/(CFU/mL);X为ddPCR中20 µL体系的拷贝数/(copies/20 µL);V1为DNA提取最终的定容体积/µL;V2为DNA提取的菌悬液体积/mL;V3为ddPCR反应体系中DNA模板体积/µL。

1.3.6 模拟双歧杆菌婴幼儿配方乳粉样品的平板计数及ddPCR检测

称取未添加双歧杆菌的婴幼儿配方乳粉5 g,置于装有44 mL生理盐水的均质袋内,将37 ℃厌氧培养48 h的双歧杆菌HN019菌悬液10-1~10-5稀释度菌液各1 mL,至于均质袋中,用拍击式匀浆器拍击2 min,制成质量比为1∶10的样品匀液,各添加水平分别设3 个样品重复,另取1 份无菌称样5 g婴儿乳粉样品加入45 mL生理盐水,代替添加菌液作为阴性对照品,将以上5 个浓度添加水平的婴儿配方乳粉样品溶液,分别梯度稀释进行平板计数方法检测。同时取各样品溶液各1 mL用1.3.1.2节方法提取DNA,最终将核酸溶解在100 µL TE缓冲液中,并进行ddPCR检测。ddPCR对样品的检测结果对应的菌液浓度可由1.3.5.2节公式换算得到,将其定量结果与平板计数定量结果进行比较。

1.3.7 实际婴幼儿配方乳粉样品的平板计数及ddPCR检测

对市售10 份不同厂家的添加双歧杆菌的婴幼儿配方乳粉样品,应用1.3.1.2节方法提取基因组DNA并进行ddPCR定量检测,每个样品取2 个平行样品,每个平行样品做3 次重复,同时对样品应用平板计数方法定量检测,比较2 种方法的定量结果的一致性。

本文章来源于——《食品科学网》,如有版权问题,请与本网联系

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